翟梅枝,郭琪,賈彩霞,張新華
(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西楊凌712100)
摘 要:以總黃酮回收率為考察指標(biāo),研究了大孔樹脂分離純化核桃青皮總黃酮的工藝。結(jié)果表明:D101型樹脂對核桃青皮總黃酮有較好的吸附分離性能,是分離純化核桃青皮總黃酮的適宜大孔樹脂;最佳工藝條件為:上柱總黃酮與干樹脂質(zhì)量比為1∶12,上樣液質(zhì)量濃度可在3. 087 5~6. 175 g/L范圍內(nèi), pH值為5, 6BV(1BV=23. 7mL)的水洗后用5BV的70%乙醇洗脫。經(jīng)D101處理后的核桃青皮總黃酮回收率在60%,純度可達80%以上。該工藝簡便,能有效分離純化核桃青皮黃酮類化合物。
關(guān)鍵詞:核桃青皮;總黃酮;大孔吸附樹脂;分離純化
中圖分類號:TQ91;TQ425 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1673-5854(2008)03-0021-05
核桃(Juglans regiaLinn. )是核桃屬植物中經(jīng)濟價值最高的一種,在我國栽培歷史悠久,資源豐富,到2004年,我國核桃樹的栽培面積約91. 75 hm2, 2億株左右,面積和株數(shù)都居世界第一位,年產(chǎn)堅果27. 424 6萬噸,核桃青皮35萬噸[1]。目前核桃研究大多集中在良種選育、生理生化、栽培及病蟲害防治、堅果的加工利用等方面,核桃青皮是核桃生產(chǎn)中的副產(chǎn)品,一直作為廢棄物棄之不用,廢棄的青皮不僅污染環(huán)境,也是自然資源的浪費。近年來大孔吸附樹脂已廣泛應(yīng)用于植物有效成分的富集和分離[2-6],有關(guān)核桃青皮黃酮類化合物的研究目前未見報道,為了充分利用這一植物資源,本研究以總黃酮回收率為考察指標(biāo),對大孔樹脂分離純化核桃青皮中的總黃酮進行了研究。
1 實驗
1.1 材料、試劑與儀器
核桃青皮:采自渭北核桃主產(chǎn)區(qū)黃龍縣,自然晾干后,在45℃左右的烘箱中烘干,粉碎過孔徑0. 84mm篩,然后密封于塑料袋內(nèi),備用; D101、LSA-21、LSA-40、XDA-1型樹脂購于西安藍曉樹脂公司; LS300、LS303型樹脂購于西安藍深樹脂公司;蘆丁對照品,中國藥品生物制品檢定所;所有試劑均為西安化學(xué)試劑廠分析純;層析玻璃柱(15mm×400mm);UV1810型紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海醫(yī)械專機廠; SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵,上海錦華層析設(shè)備廠。
1.2 方法
1.2.1 總黃酮量測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,測得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=0.133 5+0.000 1X, r=0.999 6。
1.2.2 核桃青皮上樣液制備及其總黃酮量測定
取核桃青皮粉1 kg,用70%的乙醇回流提取4次,抽濾,合并濾液,回收乙醇至無醇味,并用蒸餾水定容至5 000mL,取少量按照1.2.1節(jié)的方法測定其總黃酮量(以質(zhì)量濃度計,下同)。
1.2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 本實驗根據(jù)樹脂生產(chǎn)廠家提供資料,以95%乙醇浸泡24 h后, 4倍體積95%乙醇洗脫,控制流速1mL/min,再以大量蒸餾水洗至中性,備用。
1.2.4 不同型號樹脂篩選的研究
1.2.4.1 靜態(tài)吸附解吸實驗 準(zhǔn)確稱取一定量處理好的各種樹脂,置于100mL錐形瓶中,分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為4. 635 g/L的上樣液50mL,每隔10min振搖20 s,持續(xù)2 h,靜止24 h后,過濾,得液體樣品,按1.2.1節(jié)操作測定其吸附后濾液質(zhì)量濃度。將濾出后的樹脂用蒸餾水洗去樹脂表面的上樣液,另置100mL錐形瓶中,精確加入70%乙醇20mL,每隔10min振搖20 s,24 h后,過濾,得液體樣品,按照1.2.1節(jié)的方法測定解吸后濾液質(zhì)量濃度。按照下式計算各樹脂對核桃青皮總黃酮的靜態(tài)飽和吸附量(mg/g)、解吸量(mg/g)和解吸率(% )。
飽和吸附量=(樣液質(zhì)量濃度-吸附后濾液質(zhì)量濃度)×樣液體積/干樹脂質(zhì)量;
解吸量=解吸后濾液質(zhì)量濃度×解吸液體積/干樹脂質(zhì)量;
解吸率=解吸量/飽和吸附量×100%
1.2.4.2 動態(tài)吸附解吸實驗 準(zhǔn)確稱取一定量處理好的各種樹脂,濕法裝柱,吸取總黃酮質(zhì)量濃度為5. 186 g/L的上樣液100mL,上樣吸附,過柱液重吸附一次,靜置12 h,蒸餾水洗脫至無色后,用70%乙醇洗脫,將各吸附后殘液、水洗液、醇洗脫液濃縮至一定體積,按照1.2.1節(jié)的方法測定各部分的總黃酮量。按下列公式計算比吸附量(mg/g)、比洗脫量(mg/g)和總黃酮回收率(% )。
比吸附量=(上柱總黃酮質(zhì)量-殘液中總黃酮質(zhì)量-水洗液中總黃酮質(zhì)量) /干樹脂質(zhì)量;
比洗脫量=醇洗脫液中總黃酮質(zhì)量/干樹脂質(zhì)量;
總黃酮回收率=醇洗脫液中總黃酮質(zhì)量/上柱總黃酮質(zhì)量×100%
1.2.5 D101樹脂分離純化核桃青皮總黃酮的工藝優(yōu)化
1.2.5.1 上樣量的確定 取處理好的樹脂6份(相當(dāng)于干樹脂約4. 4 g,下同),濕法裝柱,分別吸取總黃酮質(zhì)量濃度為6. 175 g/L的上樣液30、40、50、60、70和120mL,上柱吸附完全后用6BV(BV為柱床體積,相當(dāng)于23. 7mL,下同)的蒸餾水洗柱,再用5BV的70%的乙醇洗脫,將醇洗脫液濃縮至一定體積,測定總黃酮量和回收率。
1.2.5.2 上樣液濃度的確定 取處理好的樹脂5份,濕法裝柱,再取上樣液60mL5份,一份濃縮至30mL,一份不處理,另3份分別加水稀釋1、2和3倍,質(zhì)量濃度依次為12. 350 0、6. 175 0、3. 087 5、2. 058 3和1. 544 0 g/L。上柱吸附完全后,用6BV的蒸餾水洗柱,再用5BV的70%乙醇洗脫,將醇洗脫液濃縮至一定體積,測定總黃酮量和回收率。
1.2.5.3 上樣液pH值的確定 取處理好的樹脂7份,濕法裝柱,取上樣液60mL用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH,分別調(diào)pH值為2、3、4、5、6、7和8,上柱吸附完全后,用6BV的蒸餾水洗柱,再用5BV的70%乙醇洗脫,將醇洗脫液濃縮至一定體積,測定總黃酮量和回收率。
1.2.5.4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮回收率及純度的影響 取處理好的樹脂5份,濕法裝柱,取60mL上樣液上柱吸附完全后,用6BV蒸餾水洗柱后,再分別用10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫,每種洗脫液收集5BV,濃縮各部分液體樣品,測定總黃酮量和回收率。
1.2.5.5 水洗體積對總黃酮回收率及純度的影響 取處理好的樹脂4份,濕法裝柱,取60mL上樣液上柱吸附完全后,分別用2、4、6和8BV的蒸餾水洗脫,再用5BV的70%乙醇洗脫,將水洗液、醇洗液濃縮到一定體積,測定各部分的總黃酮量,計算總黃酮純度。
純度=洗脫液中總黃酮質(zhì)量/干物質(zhì)質(zhì)量×100%
1.2.5.6 洗脫終點的確定 取處理好的樹脂適量,濕法裝柱,取60mL上樣液吸附完全后,用6BV蒸餾水洗柱,再用70%的乙醇洗脫,按柱床體積收集,共收集8個洗脫份,測定每個洗脫份的總黃酮量。
2 結(jié)果與討論
2.1 6種樹脂的靜態(tài)-動態(tài)吸附解吸結(jié)果
用6種樹脂對核桃青皮粗提液進行處理,其靜態(tài)和動態(tài)的飽和吸附量、解吸率、總黃酮回收率如表1、表2所示。大孔樹脂對有效成分的吸附具有可逆性,在靜態(tài)和動態(tài)吸附解吸實驗中,由于樹脂的極性、孔徑、比表面積的不同,對總黃酮吸附作用力強弱不同,解吸難易也不同。LSA21、LS303、D101三種樹脂在靜態(tài)吸附解吸中具有較大的吸附量和解吸量。在動態(tài)吸附解吸時,D101型樹脂無論是在比吸附量、70%乙醇洗脫總黃酮質(zhì)量、比洗脫量、總黃酮回收率均優(yōu)于其他類型的樹脂, 70%乙醇洗脫的總黃酮質(zhì)量和總黃酮回收率為253. 78mg和48. 93%,比LSA40型樹脂的洗脫量169. 75mg和回收率32. 73%分別高出84. 03mg, 16. 2%。故選用D101型樹脂作為分離純化核桃青皮總黃酮的適宜樹脂。
2.2 D101型樹脂吸附分離核桃青皮總黃酮的工藝優(yōu)化
2.2.1 上樣量對總黃酮回收率的影響 表3顯示,當(dāng)樹脂量一定,增加上柱量,由于吸附不完全,過柱液和水洗液造成總黃酮流失,總黃酮回收率明顯降低,同時還會導(dǎo)致吸附選擇性變差;若上柱量過少即吸附劑用量過多,雖總黃酮回收率較高,但會使成本增高,所以上柱量與樹脂量要有合理的比例關(guān)系。當(dāng)上柱量與干樹脂質(zhì)量比為1∶12時,總黃酮回收率即可達50%以上,綜合以上因素選用上柱量與干樹脂質(zhì)量比1∶12為宜。
2.2.2 上樣液質(zhì)量濃度對總黃酮回收率的影響
圖1表明,在上樣液總黃酮量固定的情況下,當(dāng)上樣液的濃度增大時,總黃酮回收率不斷增大,但是當(dāng)質(zhì)量濃度增大到12. 35 g/L時,因濃度過大,發(fā)生絮凝和沉淀,回收率下降;而上樣液濃度偏低時,時間增加,工效降低;在原液和稀釋一倍的濃度下,總黃酮回收率相差不大,實際中,上樣液質(zhì)量濃度可在3. 087 5~6. 175 g/L范圍內(nèi),所以,在本研究不考察其他因素時,選擇制備好的上樣液(質(zhì)量濃度6. 175 g/L)直接上樣,不必稀釋。
2.2.3 上樣液pH值對總黃酮回收率的影響 上樣液酸堿度對樹脂吸附有一定影響,故將上樣液pH值調(diào)成2~8七種不同酸堿度的溶液,實驗中發(fā)現(xiàn)不同pH值的上樣液其澄清度差異較大。當(dāng)上樣液pH值為2和3時,上樣液有不同程度的沉淀,特別是pH值為2時,溶液產(chǎn)生大量絮狀沉淀,使樹脂結(jié)塊,堵塞樹脂柱;當(dāng)pH值≥5時,溶液澄清透明,上柱效果較好。
從圖2可看出,隨著pH值的升高總黃酮回收率逐漸增大,在pH值為5時,回收率達到最大,為57. 88%,隨著pH值的升高,總黃酮回收率反而下降。這是因為在弱酸條件下,黃酮類化合物以分子形式存在,故易于被吸附。但酸性較強時黃酮分子易形成佯鹽,偏堿時黃酮分子上酚羥基的氫解離形成酸根離子,黃酮類化合物形成離子結(jié)構(gòu),被樹脂吸附的能力就減弱[8-9],故確定上樣液適宜pH值為5。
2.2.4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮回收率的影響
從圖3可看出:隨著乙醇體積分數(shù)的增加,核桃青皮總黃酮的回收率增加,當(dāng)乙醇體積分數(shù)為70%時,核桃青皮總黃酮回收率的變化趨于平緩,說明核桃青皮總黃酮已經(jīng)基本上被解吸下來,為節(jié)約成本,減少醇揮發(fā)帶來的損失,選擇70%的乙醇對樹脂進行洗脫。
2.2.5 水洗體積對總黃酮回收率和純度的影響
從圖4可以看出,隨著水洗體積的增加,水洗脫總黃酮量增大,總黃酮回收率下降,但純度有所提高,考慮經(jīng)濟、工效以及后續(xù)工作對純度要求,選用6倍柱體積的水洗脫較好。
2.2.6 洗脫終點的確定
從表4可以看出,當(dāng)洗脫液70%乙醇用量為5BV時,總黃酮的總回收率已達到59. 07%,基本上將總黃酮大部分洗凈,考慮到增加洗脫液用量,不僅增加生產(chǎn)成本,同時脂溶性雜質(zhì)增多,故確定洗脫5BV的70%乙醇為洗脫終點。
2.3 D101型大孔樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察按照以上篩選結(jié)果所得優(yōu)化條件,重復(fù)使用樹脂10個周期,測定總黃酮回收率和純度,見表5。
由表5可看出,大孔樹脂連續(xù)使用5次以后,由于核桃青皮提取物中含有大量色素,樹脂顏色變深,殘留在樹脂上的雜質(zhì)較多,使吸附能力減弱,核桃青皮總黃酮的回收率和純度都有所下降,需要進行再生處理。
3 結(jié)論
3.1 D101型大孔樹脂對核桃青皮總黃酮具有良好的吸附和解吸性能,用其純化核桃青皮總黃酮是可行的。
3.2 D101型大孔樹脂分離純化核桃青皮總黃酮的最佳條件是:上樣液總黃酮與干樹脂質(zhì)量比1∶12,上樣液質(zhì)量濃度為3. 087 5~6. 175 g/L范圍內(nèi), pH值為5,依次用6倍體積蒸餾水、5倍體積70%乙醇洗脫,總黃酮回收率60%,純度80%以上。該工藝具有收率高、成本低、操作簡便、溶劑安全等特點,適宜在大規(guī)模生產(chǎn)中選用。
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